Czy Polska będzie czerpała korzyści, jake może dać uprawa lnu zmodyfikowanego genetycznie?

Komitet biotechnologii rekomendował do nagrody premiera RP efekty pracy prof. Jana Szopy z Wydziału Bioteechnologii Uniwersytetu we Wrocławiu, za efekty badań nad lnem zmodyfikowanym genetycznie. Wiecej szczegółów tego opracowania zawiera załączony autoreferat autora tytch badań.

Podstawy wytwarzania nowej generacji surowców opartych na lnie uprawnym

Prof. dr hab. Jan Szopa
Wydział Biotechnologii
Uniwersytet Wrocławski
Ul. Przybyszewskiego 63/77
51-148 Wrocław
Ten adres pocztowy jest chroniony przed spamowaniem. Aby go zobaczyć, konieczne jest włączenie w przeglądarce obsługi JavaScript.

Wprowadzenie

Len (Linum usitatissimum) jest rośliną, która może być źródłem surowcowym dla medycyny i szeroko pojętego przemysłu. Nasiona lnu zawierają od 40 do 45 % tłuszczu o dużej wartości odżywczej ze względu na wysoką zawartość kwasów tłuszczowych wielonienasyconych a w tym kwasu linolenowego (ALA) i linolowego (LA). ALA jak i LA nie są syntetyzowane w organizmie ludzkim i dlatego są bardzo ważnym elementem naszej diety stanowiąc substraty do syntez kwasów tłuszczowych grupy ω3 i grupy ω6. ALA jest substratem do syntezy istotnych składników błon plazmatycznych tj. kwasów eikozapentanowego (EPA) i dokozaheksanowego (DHA) oraz powstających z nich czynników regulatorowych (eikozanoidów), natomiast LA daje początek syntezie kwasu arachidonowego i eikozanoidom pochodzącym z metabolizmu tego kwasu. Spożywanie ALA powoduje wzrost elastyczności i płynności błon plazmatycznych. Badania wykazują, iż spożywanie ALA obniża ryzyko zachorowania na niektóre nowotwory oraz zawał mięśnia sercowego.

Rośliny lnu są również ważnym źródłem wartościowego włókna. Wartość włókna polega na tym, że zawierają oprócz celulozy niewielką ilość składników o działaniu przeciwutleniającym co czyni je lepszym od włókna bawełnianego zawierającego wyłącznie celulozę. Obecność naturalnych antyoksydacyjnych składników sprawia, że jest możliwym ich biotechnologiczne zwiększenie do poziomu takiego, aby włókna można było użyć do wytworzenia nie tylko tekstyliów, ale również do produkcji opatrunków medycznych, nici chirurgicznych i wszędzie tam gdzie zastosowanie przeciwutleniaczy jest korzystne.

Polska posiada wieloletnie tradycje w uprawie i przetwórstwie lnu, które w ostatnim dwudziestoleciu zostały zaniedbane. Jeszcze w latach 1955-1974 tylko na Dolnym Śląsku len uprawiano na powierzchni 10 000 do 19 000 ha, przy czym wg Stowarzyszenia Euro-Textil-Region Czechy-Niemcy-Polska region dolnośląski dysponuje 170 000 ha nadającymi się pod uprawę lnu i od 2000 roku Stowarzyszenie zabiega o zwiększenie upraw. Aktualnie wg źródeł UE powierzchnia upraw lnu w całym Kraju nie przekracza 8 000 ha. Dramatyczny spadek zainteresowania uprawą lnu ma swoją przyczynę w niedostatecznym rozwoju prac nad ulepszaniem i pozyskiwaniem nowoczesnych odmian. Odnowienie uprawy lnu w Polsce jest wysoce zasadne, dlatego, że mamy odpowiedni klimat i jakość gleb oraz wieloletnią tradycję w jego uprawie i przetwórstwie.

Niekorzystną cechą lnu jest jego niska biomasa, która może być skompensowana przez niemal bezodpadowe wykorzystanie.

Zmierzając do nadania znanej i cennej roślinie uprawnej, jaką jest len, takich współcześnie oczekiwanych właściwości, które pozwolą na jej przywrócenie rolnictwu w Polsce oraz pobudzą do korzystania z tego surowca rodzimy przemysł przetwórczy - odnawiając tradycje związane z tą uprawą opracowano sposób genetycznej modyfikacji lnu [1]. Przy użyciu opracowanej techniki modyfikacji, podjęto wielokierunkowe działania mające na celu takie ulepszenie lnu, aby stał się atrakcyjnym surowcem dla medycyny i przemysłu a przez to zapewnił korzyści również rolnikowi.

Opis osiągnięcia

Wielokierunkowe działania polegały na wytworzeniu konstrukcji genowych, których skuteczność sprawdzano najpierw modyfikując ziemniaki a następnie len uzyskując rośliny o zwiększonej odporności na czynniki środowiska. Do zwiększenia odporności zastosowano nowe podejście badawcze polegające na zwiększeniu potencjału antyoksydacyjnego roślin przez wzmocnienie syntezy flawonoidów [2, 3] oraz ich zwiększonej stabilizacji [4, 5] jak również na wprowadzeniu geny beta-glukanazy [6]. Największe zwiększenie odporności na fuzariozę uzyskano drogą zwiększenia akumulacji związków ze szlaku fenylopropanoidowego przez nadekspresję genu transferazy glukozowej. Równocześnie tworzono len o zwiększonej trwałości oleju oraz poprawionej jakości włókna.

Mankamentem aktualnie dostępnych odmian lnu jest wysoka labilność kwasów tłuszczowych w procesie produkcji oleju z nasion. Wzbogacenie nasion lnu w antyoksydanty rozpuszczalne w tłuszczach (pochodne izoprenoidowe) i wodorozpuszczalne (pochodne fenylopropanoidowe) okazuje się być skutecznym sposobem zwiększenia trwałości oleju a tym samym ochrony kwasów tłuszczowych przed utlenieniem. Ta część badań jest na różnym etapie rozwoju i tak opublikowano dane o skutecznym działaniu flawonoidów na ochronę kwasów tłuszczowych przed utlenieniem [2, 3] natomiast wyniki badań również pozytywnego działania izoprenoidów wysłano do druku. Nie ulega jednak najmniejszej wątpliwości, że oba sposoby są skuteczne i dalszym celem jest opracowanie technologii przygotowania kapsułek z olejem lnianym wzbogaconym w izoprenoidy i flawonoidy jako suplementu diety, co powinno przynieść pozytywny skutek w profilaktyce leczenia miażdżycy i chorób niedokrwiennych serca.

Mankamentem włókna lnianego pochodzącego z aktualnie uprawianych odmian jest jego niska jakość produkcyjna wynikająca z obecności pektyn, hemiceluloz i lignin. Obniżenie poziomu lignin uzyskuje się przez zbiór roślin przed zakończeniem wegetacji, co wpływa na obniżoną produktywność. Pektyny i hemicelulozy usuwa się w długotrwałym procesie roszenia, który niekorzystnie wpływa na jakość włókna. Wytworzono zatem rośliny nowego lnu o skróconym procesie roszenia [7]. Zabieg polegał na wprowadzeniu dwóch genów kodujących grzybową poligalakturonazę i ramnogalakturonazę degradujących pektyny i dlatego przyspieszających roszenie słomy lnianej. Nadto enzymatyczne produkty ekspresji tych genów podwyższały oporność roślin na fuzariozę.
Wytworzono również rośliny nowego lnu o zmniejszonej zawartości lignin [8], co osiągnięto przez wyciszenie genu endogennego kodującego dehydrogenazę aldehydu cynamonowego. Włókna tych roślin odznaczają się większą sprężystością i elastycznością.

Inną z wprowadzonych modyfikacji mających poprawić jakość włókna było wytworzenie lnu „plastikowego”. Równoczesne wprowadzenie trzech genów bakteryjnych kontrolujących syntezę polihydroksymaślanu (PHB) pod kontrolą promotora swoistego dla włókien zaowocowało wytworzeniem włókna kompozytowego [9, 10]. Analiza w podczerwieni włókien nowego lnu wykazała wytworzenie się wiązań wodorowych i estrowych między polimerami celulozy i PHB w trakcie wzrostu rośliny [11, 12]. Ten nowy rodzaj włókna jest doskonałą składową kompozytów z polipropylenem nie zmieniając właściwości wytrzymałościowych polipropylenu natomiast czyniąc go biodegradowalnym, nie agregującym płytek krwi i bakteriostatycznym [Patent P 386186, 2008].

Obok poprawy jakości głównych produktów pochodzących z lnu takich jak olej i włókno, celem działań stało się wykorzystanie wytłoków nasiennych do izolacji immunoterapeutycznych biomolekuł jak lignany i kanabinoidy oraz szeregu antyoksydantów z odpadów słomy po wydzieleniu włókna [Patent P 386185, 2008].

Każdemu z wyszczególnionych działań mających na celu zwiększenie opłacalności upraw lnu towarzyszyły cele poznawcze. I tak uzyskano nowe promotory genów charakteryzujące się swoistością ekspresji we włóknach lnianych (promotor 16R i 20R) i silnie indukowany chłodem i promieniowaniem UV promotor genu transferazy glukozowej oraz regulowany w rozwoju promotor genu DOF [13-15]. Do wyciszenia genu CAD użyto nowoczesnej technologii RNAi z pozytywnym skutkiem. Stwierdzono, że do syntezy karotenoidów najlepiej nadają się geny bakteryjne crtB i crtI, natomiast do syntezy skwalenu zastosowano nowe podejście badawcze polegające na wyciszeniu szlaku diterpenoidowego, przez co nadmiar substratów z tego szlaku został przekierowany do syntezy triterpenoidów. Innymi słowy w tym ostatnim przekierowano substraty gromadzące się po zablokowaniu syntezy karotenu do syntezy skwalenu (praca wysłana do druku). Dla roślin pochodzących z każdej modyfikacji wyznaczono profile metaboliczne dające pogląd o współzależności dróg wtórnego metabolizmu w lnie, co zostanie wykorzystane do dalszych zabiegów wzmocnienia syntezy związków immunoterapeutycznych w zastosowaniach w medycznych.

Wszystkie wyszczególnione przedsięwzięcia miały na celu przygotowanie bazy nowych genów (ponad 30 genów zgromadzono w bazie danych http//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide), konstrukcji genowych, zmodyfikowanych roślin i technologii pozyskiwania nowych bioaktywnych preparatów dla potrzeb medycyny i przemysłu. Realizacja przedsięwzięć powiększyła potencjał merytoryczny i technologiczny instytucji naukowych oraz w przyszłości pozytywnie wpłynie na konkurencyjność gospodarki przez dostarczenie surowców o zupełnie nowej jakości w porównaniu do dotychczasowej wartości surowca lnianego.

Wykaz najważniejszych efektów (publikacje, patenty)

1. Rutkowska Rutkowska-Krause I., Mańkowska G., Łukaszewicz M., Szopa J. Regeneration of flax (Linum usitatissimum) plants from anther culture and somatic tissue with increased resisatance to Fusarium oxysporum. Plant Cell Rep. 22 (2003) 110-116.
2. Lorenc-Kukuła K., Amarowicz R., Oszmiański J., Doermann P., Starzycki M., Skała J., Żuk M., Kulma A., Szopa J. Pleiotropic effect of phenolic compounds content increases in transgenic flax plant. J.Agric.Food Chem.53 (2005) 3685-3692.
3. Lorenc-Kukuła K., Wróbel-Kwiatkowska M., Starzycki M., Szopa J. Engineering flax with increased flavonoid content and thus Fusarium resistance. Physiol.Molec. Plant Pathol. 70 (2007) 38-48.
4. Lorenc-Kukuła K., Jafra S., Oszmiański J., Szopa J. Ectopic expression of anthocyanin 5-O-Glucosyltransferase in potato tuber causes increased resistance to bacteria. J.Agric.Food Chem. 53 (2005) 272-281.
5. Aksamit-Stachurska A, Korobczak-Sosna A, Kulma A, Szopa J. Glycosyltransferase efficiently controls phenylpropanoid pathway. BMC Biotechnology (2008), 8:25.
6. Wróbel-Kwiatkowska M., Lorenc-Kukuła K., Starzycki M., Oszmiański J., Kępczyńska E., Szopa J. Expression of beta-1,3-glucanase in flax causes increased resistance to fungi. Physiol.Molec. Plant Pathol., 65 (2005) 245-256.
7. Musialak M., Wróbel-Kwiatkowska M., Starzycka E., Szopa J. Improving retting of fibre through genetic modification of flax to express pectinases. Transgenic Res. 17 (2008) 133-147.
8. Wróbel-Kwiatkowska M., Starzycki M., Żebrowski J., Oszmiański J., Szopa J. Lignin deficiency in transgenic flax resulted in plants with improved mechanical properties. J.Biotechnol. 128 (2007) 919-934.
9. Wróbel M., Żebrowski J., Szopa J. Polyhydroxybutyrate synthesis in transgenic flax. J.Biotechnol. 107 (2004) 41-54.
10. Wróbel-Kwiatkowska M., Starzycki M., Żebrowski J., Oszmiański J., Szopa J. Engineering of PHB synthesis causes improved elastic properties of flax fibers. Biotechnol.Prog. 23 (2007) 269-277
11. Wróbel-Kwiatkowska M., Szopa J., Dymińska L., Mączka M., Hanuza J. Spectroscopic characterization of genetically modified flax fibres enhanced with poly-3-hydroxybutyric acid. J.Molec.Struct. 920 (2009) 214-219.
12. Wróbel-Kwiatkowska M., Skórkowska-Telichowska K., Dymińska L., Mączka M., Hanuza J., Szopa J. Biochemical, Mechanical, and Spectroscopic Analyses of Genetically Engineered Flax Fibers Producing Bioplastic (Poly-beta-Hydroxybutyrate). Biotechnol.Prog., in press.
13. Aksamit A., Korobczak A., Skała J., Łukaszewicz M., Szopa J. The 14-3-3 gene expression specificity in response to stress is promoter dependent. Plant Cell Physiol. 46 (2005) 1635-1645.
14. Korobczak A., Aksamit A., Łukaszewicz M., Lorenc K., Rorat T., Szopa J. The potato glucosyltransferase gene promoter is environmentally regulated. Plant Sci. 168 (2005) 339-348.
15. Skirycz A., Reichelt M., Burow M., Birkemeyer C., Rolcik J., Kopka J., Zanor M. J., Gershenzon J., Strnad M., Szopa J. Mueller-Roeber B., Witt I. DOF transcription factor AtDof1.1 (OBP2) is part of a regulatory network controlling glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis. Plant J. 47 (2006) 10-24.

Wybrane zgłoszenia patentowe:

1. Szopa J., Skała J., Lorenc-Kukuła K., Borkowski M., Majorkowski J. Sposób genetycznej modyfikacji roślin, zwłaszcza lnu. P 364332, 2004.
2. Szopa J., Skórkowska-Telichowska K., Żuk M. Tkanina, zwłaszcza do wytwarzania opatrunków. P 386185, 2008
3. Szopa J., Wróbel-Kwiatkowska M., Kulma A. Biokompozyt zawierający zmodyfikowany genetycznie len i jego zastosowanie. P 386186, 2008.

Wybrane patenty:

1. Szopa J., Łukaszewicz M., Skała J. Zmodyfikowany wektor binarny pBinAR. P345926, 2006.
2. Szopa J., Wilczyński G. Zrekombinowana sekwencja DNA, wektor obejmujący zrekombinowaną sekwencję DNA, białka otrzymane przez ekspresję zrekombinowanej sekwencji DNA oraz komórka mikroorganizmu lub komórka roślinna lub protoplast transformowane zrekombinowaną sekwencją DNA (Gen 16R). P344766, 2007.
3. Szopa J., Wilczyński G. Zrekombinowana sekwencja DNA, wektor obejmujący zrekombinowaną sekwencję DNA, białka otrzymane przez ekspresję zrekombinowanej sekwencji DNA oraz komórka mikroorganizmu lub komórka roślinna lub protoplast transformowane zrekombinowaną sekwencją DNA (Gen 20R). P344765, 2007.
4. Szopa J., Wróbel M. Sposób wytwarzania lnu o podwyższonym poziomie polihydroksymaślanu. P351772, 2008.